按照实验需求，质粒构建分为克隆质粒，表达质粒，基因敲除质粒，报告质粒，病毒质粒，基因组工程质粒等。
这部分以pEGF-N1为backbone，human p53 coding sequence 为插入序列，用传统的双酶(EcoR I和BamH I)切重组质粒的方法，介绍质粒元件和snapgene的基本操作流程。
1. Snapgene 打开pEGF-N1
SnapGene打开新文件的方式有两种，一种是找到质粒的全部序列，复制粘贴或者直接将质粒序列TXT文档拖拽到snapgene，snapgene会自动识别，即可打开质粒图谱；另外一种是输入，NCBI序列，addgene序列，snapgene在线序列，输入想要查找的质粒名称/编号，即可在线加载出来质粒。全面的是打开snapgene弹出的界面，后面的是通过工具栏打开新文件。
收藏的工具是将多个质粒全部放在一个收藏夹中，相当于照片放在相册里，打开一个收藏夹就是你自己保存的质粒组，方便进行质粒的管理，但是这个功能sanpgene viewer没有。
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2. pEGF-N1
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大部分元件如复制起点，抗性基因，蛋白标签等在前面已经介绍过了，还有模糊的可以翻回去看看，这里补充一下终止子。
终止子：顾名思义就是终止mRNA转录的因子，界定了一个转录单元的结束，位于基因下游，通常紧跟着polyA(聚腺苷酸：多个腺苷酸(A)，在真核中ployA能延长转录本的寿命，保持稳定；原核生物中加快转录本的讲解)。
原核的转录子分为两类：一类是依赖 ρ因子(Rho)，一类是不依赖的。ρ因子是一种解旋酶，能够辅助RNA聚合酶转录终止，此系统在质粒中比较少见；在细胞表达质粒中常见的是非ρ因子依赖的终止子。非依赖性ρ因子是一种固有强终止子，即富含GC的回文结构，富含氢键。下图为非典型ρ因子终止子示意图。几乎所有常用细胞表达质粒都是非ρ因子终止子，包括T7，rrnB等。
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真核的转录在启动子的时候讲过按照核酶分为三类，核酶I，II，和III。每种核酶终止方式不同，核酶I用来转录rRNA，依赖ρ因子类似原核；核酶II转录mRNA和miRNA，依赖ρ因子和RNA酶相关蛋白参与招募剪切和加polyA；聚合酶III转录tRNA和smRNA，依赖特定RNA二级结构和特定序列。
哺乳动物细胞表达质粒常用于转录mRNA，常用终止子有SV40，hGH，BGH和rbGlob等，polyA信号序列同终止序列是同意的。
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如上图所示，在polyA与富含GU之间协同进行切割，释放mRNA和核酶，polyA尾在mRNA核外转运和翻译过程中起维持mRNA稳定、避免其被降解的重要作用。但是在病毒载体中，polyA与包装系统连用，会降低病毒滴度，延长转录本的寿命，所以使用较弱的终止信号。
3. Human p53 设计引物
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在NCBI中搜索human p53，找到相对应的mRNA序列，搜索找到CDS区域，如图中深色部分，然后复制粘贴到snapgene中，用来构建引物。
将human p53的CDS 按照前面添加DNA文件的方法，在snapgene中打开，选择BamHI酶和EcoRI酶进行酶切，引物设计需要添加酶切位点和保护碱基。
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按照自己需要，命名完整准确，酶切问点可以在snapgene中选择添加，保护碱基可以百度查看。
使用snapgene模拟功能，能够看到PCR反应产物，有两个酶切位点存在，将扩增产物保存好。
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4. 克隆
在snapgene中有模拟克隆的功能，能够将双酶切克隆的结果可视化，让自己做到心中有数。行动--限制和插入片段克隆--插入片段。
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选择好各自的酶切位点，即可看到自己设计的质粒。这部分主要以双酶切重组质粒为基础，快速熟悉snapgene的简单引物设计，PCR反应，插入片段克隆以及补充的终止子等，希望能有所帮助。
