学习一篇文献：Onco-fetal Reprogramming of Endothelial Cells Drives Immunosuppressive Macrophages in Hepatocellular Carcinoma，2020年发表于Cell，DOI号：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.040。
概述: 人类肝脏从发育到疾病的单细胞图谱表明，在胚胎肝脏和肝细胞癌中，存在一个共享的肿瘤-胚胎生态系统驱动免疫抑制。
In Brief: A single-cell atlas of human liver from development to disease suggests a shared onco-fetal ecosystem driving immunosuppression in fetal liver and hepatocellular carcinoma.
一个优势的肿瘤生态系统可以使恶性细胞在营养剥夺和免疫选择压力下生存。肿瘤的不同区域可以代表由不同的肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞组成的肿瘤生态系统的异质性。这种区域性肿瘤内异质性（ITH）可以促进细胞间相互作用变化，影响临床治疗反应。
肿瘤细胞具有表型可塑性（phenotypic plasticity），促进细胞多样性和肿瘤进化。有文献证明，胚胎发育和肿瘤发生之间存在相似性，印证了肿瘤细胞可以重编程和/或转分化为癌症干细胞样细胞（CSC）的观点。此外，已知一些恶性细胞表达胚胎发育特异性抗原，一个典型的例子是肝细胞癌（HCC）中表达甲胎蛋白（AFP）。以上，这些研究将恶性细胞的表型特征与早期发育联系起来。
进而引出本文的主题：生成一个全面的从发育到疾病的人类肝脏图谱，在HCC中识别出一种全新的免疫抑制性“肿瘤-胚胎生态系统”，在胚胎肝和HCC中共享基质和免疫细胞类型以及信号成分。
肝癌的多区域单细胞图谱
为理解肝癌中肿瘤生态系统的复杂性以及恶性细胞、基质细胞和免疫细胞之间的动态相互作用，对14个肝癌病人（ 其中9个为乙肝阳性）和1个健康供体的多个区域的大约74,000个细胞进行scRNA-seq。
这些细胞通过Louvain算法图聚类，分成29个亚群，并进行手工注释。有趣的是，某些细胞类型中存在的肿瘤和癌旁组织的特异性分群，表明HCC中TME的潜在重塑，同时在肿瘤核心、肿瘤外周及癌旁组织中也发现了不同特征的内皮细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞。
观察到在病毒阳性和阴性肿瘤中缺乏任何特异性的免疫细胞群，表明在两种类型的HCC中肿瘤表型趋同。
肿瘤细胞中存在的病人特异性分群，突出病人特异性的驱动和乘客突变对肝上皮细胞转录组的显著影响。
肝癌中单个细胞亚群的进一步聚类，识别肿瘤相关的内皮细胞和巨噬细胞
由于观察到正常和肿瘤生态系统之间的显著差异，开始进一步深入识别疾病特异性细胞类型。
发现两种细胞类型在肿瘤和癌旁组织之间有显著的差异，内皮细胞和巨噬细胞。
对11,672个内皮细胞（ECs）进行细分，得到11个亚群， PLPP3+，IGFBP3+，PLVAP+三个亚群在肿瘤组织中富集，其中PLVAP（plasmalemma vesicle-associated protein）在肝脏发育和疾病中起到重要作用。根据VEGFR2，NRP1，ACKR1，HLADR的表达，可观察到三个HCC特异性的PLVAP+ ECs亚群。
对8102个单核吞噬细胞（MNPs）细分，得到9个亚群，巨噬细胞主要在肿瘤中富集，单核细胞和树突细胞主要富集于正常组织。根据巨噬细胞相关清道夫受体CD163的表达，可以将肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）分为CD163high TAM1和CD163low TAM2/TAM3。基因表达差别分析识别出TAM亚群的biomarker，TAM1表达FOLR2，TAM2表达SPP1，TAM3表达MT1G。
由于TAMs既可以是单核细胞来源的，也可以是组织驻留的，利用RNA velocity进一步分析，推断谱系的轨迹，得出两个FOLR2+ TAM1亚群有不同的起源，一种起源于单核细胞，另一种是胚胎起源的组织驻留巨噬细胞。前者相比后者高表达HES1，提示Notch信号在TAM1亚群中可能发挥潜在作用。得到观点，在HCC中，单核细胞来源的巨噬细胞可能被重新编程以获得胚胎样表型。
湿实验进一步验证了以上结论，即：HCC中存在 fetal-associated PLVAP+ EC 和 embryonic-like FOLR2+ TAM1。
人胚胎肝中肿瘤特异性PLVAP+ ECs和FOLR2+巨噬细胞的研究
文献有报道，PLVAP+/ NRP1+ ECs在小鼠胎肝发育过程的TRMs的分布中发挥关键功能。由此假设，肿瘤中PLVAP+ ECs的存在也可能促进TME中胚胎样巨噬细胞的出现，从而协调TME的癌胚重编程。
将人胎肝和HCC整合在一起的约105,000个细胞进行分群，整合的单细胞图谱显示了胚胎和肿瘤的内皮细胞及骨髓细胞的显著相似性。对ECs进行细分，发现PLVAP+ ECs主要富集在胚胎和肿瘤组织中，而在正常稳态中相对缺失。对MNPs细分也揭示了类似结果，胎肝巨噬细胞（FLM, cl. 6）与TAM1亚群存在显著相似，同样有着FOLR2high/CD163high的独特表达。
小鼠胚胎源、人胎肝和肿瘤巨噬细胞的跨物种比较分析
首先对“Ms4a3Cre-RosaTdT fate-mapping reporter mice”，进行细胞分选（该种模式小鼠可以区分巨噬细胞是胚胎来源（Tomato–）还是由单核细胞分化而来（Tomato+））。分选出约17,000个 Tomato–，Tomato+和CD45– 细胞，进行scRNA-seq，进而分群。
用机器学习“Garnett”算法，基于HCC的MNPs markers训练，用人胚胎肝和小鼠肝独立测试。研究这种针对HCC数据的机器学习分析能否在人胚胎和小鼠肝脏数据集中识别到类似的细胞类型。得到HCC、人胎肝和小鼠肝脏中，单核细胞和DCs具有相似性，以及HCC-TAM1、胎肝巨噬细胞（FLM）、小鼠胚胎来源的巨噬细胞间基因表达高度相似。 （HCC数据训练，HCC+Fetal数据测试，存在一定程度的数据暴露？）
VEGF信号通路在PLVAP+ ECs中的作用
VEGF信号在血管生成中起着重要作用。使用“NicheNet”通过关联配体和受体之间的基因表达预测细胞相互作用，探究肿瘤和内皮细胞之间的相互作用。识别到肝细胞来源的VEGFA可激活肿瘤内皮细胞的PLVAP。而PLVAP+ ECs的一个主要亚群表达VEGF受体，强烈暗示肿瘤肝细胞和ECs之间的通信导致了PLVAP的表达。
RNA-FISH实验观察到相比癌旁组织，在HCC中VEGFA、PLVAP、ALB和CD163表达更高，以及scRNA-seq数据相同肿瘤区域中的VEGFA、VEGFR2和PLVAP存在高度相关性，提示VEGF信号对在胎肝和HCC中出现PLVAP+ ECs起到重要性，并可能促进TME的癌胚重编程。
FOLR2+ TAMs表现出免疫抑制相互作用
假设FOLR2+ TAMs可能参与了免疫抑制性TME的调控。利用“CellPhoneDB”进行细胞-细胞相互作用分析，检测到与正常微环境相比，肿瘤中巨噬细胞和其他免疫细胞（CD4、CD8、NK、DC）之间的相互作用是正常微环境的两倍，且这些相互作用与免疫检查点受体和配体相关（CD40LG:CD40、CD28;CD86、SIRPA:CD47、CD86:CTLA4）。
在scRNA-seq数据中，Tregs和巨噬细胞代表了大多数肿瘤浸润免疫细胞，因此聚焦于巨噬细胞-Treg的相互作用，以评估TAMs在免疫调节中发挥的作用。与 SPP1+ TAM2亚群相比，FOLR2+ TAM1与Tregs表现出更多的免疫抑制相互作用。TAM1还表达更高水平的免疫调节趋化因子，如CXCL12和CXCL16以及CD86。提示TAM1可促进HCC的免疫抑制微环境。
RNA-FISH实验观察到TAM1（CD163+）、Tregs（TIGIT+）和PLVAP+ ECs共定位于相同的生态位，与ALB+ 肿瘤上皮细胞群相连，高PLVAP密度区域存在CD163+和TIGIT+细胞的富集。与SPP1+ TAM2相比，FOLR2+ TAM1与TIGIT+ 细胞的富集强调了FOLR2+ TAMs在免疫抑制相互作用中的主要作用。
小鼠胚胎源、人胎肝和肿瘤巨噬细胞中的保守性基因调控网络
假设系统阐明这些细胞类型中的基因调控网络（GRNs）有机会识别出可促进FOLR2+ TAMs的胚胎样重编程的保守性转录因子。利用“SCENIC”破译小鼠和人类骨髓细胞的GRN，然后进行基于调节子（regulon）活性的层次聚类。根据直系同源GRNs的相似度，构建小鼠和人类骨髓细胞的Pearson关联热图。将128个直系同源GRNs分成7个主要的模块，识别到小鼠胚胎源、人胎肝和TAM1共享的一个模块“Module2”，HES1、SPIC、NR1H3、MAF等转录因子表现出活性。
HES1是Notch信号通路的经典下游效应物之一，因为TME中TAM1与PLVAP+ ECs共定位，因此假设PLVAP+ ECs可能促进TAM1中Notch信号的激活，从而促进癌胚重编程。骨髓细胞表达受体NOTCH2，PLVAP+ 癌胚ECs表达配体DLL4。RNA-FISH实验推断出癌胚ECs可能是表达NOTCH2的TAM1巨噬细胞中Notch激活的潜在配体来源。
结果表明了VEGF介导的PLVAP+ ECs的诱生和DLL4+ 介导的FOLR2+ TAM1s的重编程。FOLR2+ TAM1s在TME中发挥免疫抑制作用。VEGF和NOTCH信号通路在维持肿瘤-胚胎生态系统方面起重要性。
最后的最后，重温一下Graphical Abstract以及Summary：
