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一、目的
细胞及其在组织内的组织之间的关系对于理解正常发育和疾病病理至关重要。Visium空间基因表达解决方案可测量完整组织切片中的总mRNA，并绘制出现基因活性的位置的图。
简单说，就是将基因的表达情况与切片染色图结合起来，在一个空间的维度上去理解基因表达的分布情况
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二、解决方案
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包括：
- 试剂
- 耗材
- 信息分析软件
自己实验室需要配备：
- 冰冻切片机
- 荧光显微镜
三、技术发展
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- 分辨率提升，有8w个UMI capture area，5000个点
- 每个点可以覆盖1~10个细胞
四、新技术特点
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四、原理
出于组织学目的，对新鲜冷冻的组织切片进行成像，并将其放置在包含与RNA结合的捕获探针的阵列上。将组织固定并透化以释放RNA，使其与相邻的捕获探针结合，从而捕获基因表达信息。然后从捕获的RNA合成cDNA，并制备测序文库。然后对文库测序并可视化数据，以确定表达哪些基因，在何处表达以及表达多少。
五、流程概述
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技术要点：
- 新鲜的冰冻组织
- H&E染色 + 荧光显微镜扫描
- 测序
- 信息分析
PS：对于新的组织样本等情况，在正式建库前需要进行组织优化
组织优化：（非必须）
目的：找到一个最佳的条件（可能是透化时间的长短），使组织样本中的mRNA能被最大化充分地释放出来
由此产生了一个试剂盒TOkit（组织优化试剂盒）和 GEX slide(Gene Expression试剂盒) 基因表达试剂
六、两种试剂盒
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-
TO kit (Tissue Optimization)组织优化试剂盒
- 可通过8个Capture Area对同一个样本设置8个不同的优化条件（例如透化时间等）
- 一个包装4张slide,可做四种不同样本的优化测试
-
GEX slide(Gene Expression试剂盒) 基因表达试剂
- 每张slide有4个Capture Area
- 两种规格：一张silde(4个反应） 或 4张slide（16个反应）
七、实验流程
1. 组织优化（可选）
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- slide上的oligo上没有相应的barcode
- 目的只是帮我们找到组织释放出最多mRNA的实验条件
- 对组织进行染色、透化之后，进行cDNA合成，而在dNTP上有SN3的荧光基团，便可通过荧光显微镜进行判断哪个实验条件下的组织切片所释放mRNA量最多
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- 1号为阴性对照
- 不同样本的透化时间都不相同
2. 透化与建库
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-
slide的结构
- 4个Capture Area
- 每个Capture Area尺寸为6.5mm x 6.5mm
- Capture Area中总共有约5000个capture mRNA的点
- 每个capture mRNA的点上有百万个oligo
- 每个capture mRNA的点，点的直径为55μm，点与点之间的中心距离为100μm
-
每个oligo结构：
- read1
- Sptial barcode： 用于回溯空间位置信息
- UMI ： 用于无偏计数分析
- oligo(dT)： 用于捕获真核生物RNA的PolyA尾巴
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- 对经过OTC包埋的新鲜冷冻组织进行切片，并将之放置捕获区域上
- （用甲醇）对组织进行固定、H&E染色，拍摄明场图片
- 对组织进行透化
- 释放出的mRNA的PolyA尾结合探针的oligo(dT)，反转录成cDNA
- cDNA扩增、纯化和质控；
- 片段化，末端修复，加A和连接头；
- 样本index PCR， 制备测序文库。
- 最后进行上机测序
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- 注意：应用了双重索引，i5和i7
-
而且对read2的长度也很有要求
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已经经过测试的样本：
小鼠与大鼠
image.png人类
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比较难操作的样本：
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八、分析流程
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- Cell Ranger1.0.0
- cellranger makefastq
- cellranger count
- Loupe Browser4.0.0
- 可视化
九、结果展示
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十、自己的一些思考
- 加上了双重索引、载玻片上的探针，还有捕获区域上的对齐边框，既优化了性能，又使得这项技术已经很难再用其他厂商的试剂盒替代，太会玩了。
