流感病毒提取可以用BIOG拭子RNA磁珠法提取
操作步骤
1. 请自行准备:无水乙醇、异丙醇、生理盐水、1.5mL去RNA酶离心管。
2. 取出洗涤液,按70%比例加入无水乙醇,如9mL加入21mL无水乙醇,18mL加入42mL无水乙醇,混匀。
3. 样本处理:a) 拭子:向1.5mL去RNA酶离心管中加入800μL生理盐水,将拭子收集的样本置于生理盐水中,涮洗20秒,使细胞完全脱落,贴离心管壁挤干拭子上的液体,12,000 rpm 离心5 min,弃700 μL上清,剩余100μL上清,充分振荡混匀15秒。
b) 痰液:向收集的痰液中加入4倍体积1M NaOH,室温放置30分钟,每10分钟振荡混匀一次(如痰液仍粘稠,可适当延长液化时间),12,000 rpm离心5 min,弃上清,剩余100μL上清,充分振荡混匀15秒。
4. 加入200μL 裂解液、20μL 消化液和4μL Carrier,振荡混匀,56℃温育10 分钟。
5. 冷却到室温,加入300μL异丙醇,充分混匀,再加入20μL磁珠复合液(每次使用前须充分混匀),振荡混匀3min(注意不要颠倒混匀,以防磁珠粘附于管盖内壁),静置2min。
6. 将离心管置于磁力架上放置约20s至磁珠完全吸附,开盖,彻底吸弃上清液(注意枪头不要接触磁珠)。
7. 加入600μL配制后的洗涤液,将离心管从磁力架上取下,充分振荡2min,确保磁珠完全分散。将离心管置于磁力架上放置约20s至磁珠完全吸附,开盖,彻底吸弃上清液(注意枪头不要接触磁珠)。
8. 将离心管从磁力架上取下,开盖,干燥约3-5min,至无明显乙醇气味。
9. 加入50 μL洗脱液,振荡至磁珠充分散开,室温静置2min,振荡混匀1min。
10. 将离心管置于磁力架上,待磁珠完全吸附后,小心吸取上清液至一新的1.5mL去RNA酶离心管中,提取的核酸可直接用于下游实验,或-70℃保存备用。
注意事项:
1. 为防BIOGRNA酶污染,实验过程中最好戴一次性干净手套、口罩,使用处理过的无RNA酶的容器和无RNA酶的超纯水。提取的RNA溶液可适当加入RNA保护因子(货号:51090,一般50μLRNA溶液加入2μL。)
2. 裂解液含有刺激性化学物质,操作过程请做好防护措施,避免直接接触皮肤,防止吸入口鼻,洗涤液在使用前应加入乙醇后充分混匀。
3. 如进行较多样本的批量提取,为节约时间,可先将裂解液、消化液、Carrier加入每一只离心管,混匀,再加入处理后的样本。