1. Integration of single-cell RNA sequencing and spatial molecular imaging analysis provides a map of healthy and inflamed colon

Fig 1a: 作者对6例HC、6例CD和6例UC患者样本分别进行单细胞测序及空间分子成像流程。
Fig 1b,c & Suppl Fig 1a: 样本总细胞数达46,700个，得到79个细胞群。对上皮细胞、间质细胞、B和浆细胞、T细胞、髓系细胞进行再聚类分析发现，炎性成纤维细胞、中性粒细胞和M1型巨噬细胞可见于部分CD或UC患者，但在正常对照组未见阳性表达。
Suppl Fig 2a,b: 对石蜡包埋样本进行空间分子成像检测CD45, Pan CK, CD3的表达后对特定FoVs进行Cos Mx SMI分析。
Suppl Fig 1c,d: 对scRNA-seq data和SMI data各细胞亚群进行细胞丰度的相关性分析，发现IBD患者循环、生发中心和记忆B细胞丰度明显正相关；上皮细胞与其他细胞亚群丰度存在显著相关性，而组织性成纤维细胞如固有层S1, 隐窝旁S2, 粘膜下层S3和肌粘膜层肌成纤维细胞呈正相关。有趣的是，作者发现Glia细胞丰度与BEST4 OTOP2, 结肠细胞, 上皮细胞Ribhi, M2巨噬细胞和固有层S1成纤维细胞显著正相关，而与中性粒细胞, 炎性成纤维细胞, M1巨噬细胞和炎性单核细胞等炎性细胞无明显相关或负相关。提示作者Glia细胞与肠结构形态完整性有关，而炎症微环境可能导致此类细胞减少。另外，作者利用KDE共定位分析SMI data发现DCs, different types of T cells, 成纤维网状细胞 / FRCs, cycling cells, GC B cells, B cells和 naïve B cells空间定位相近位于Neighborhood I。健康对照样本Neighborhood II、III、IV分别对应固有层、隐窝和粘膜下层区域结构。IBD患者样本可见：①中性粒细胞出现于Neighborhood I, II；②CCL20 T细胞和Inflammation-Dependent Alternative (IDA) 替代性活化巨噬细胞可出现于Neighborhood IV；③N3中性粒细胞, M1巨噬细胞, 炎性成纤维细胞和炎性单核细胞构成独特区域结构Neighborhood II。
因此，scRNA-seq与CosMx SMI的联合分析可提供结肠全面的单细胞空间形态。

Fig.1 | Integration of single cell RNA sequencing (scRNA-seq) and Spatial Molecular Imaging (SMI) provides a map of healthy and inflammatory bowel disease (IBD) colonic biopsies.

2. Transcriptional analysis at single-cell and spatial resolution reveals different populations of resident and inflammatory macrophages in the colonic mucosa

Suppl Fig 1a,3a: 作者发现不同IBD患者巨噬细胞构成比例差异明显，随后为间质细胞。提示此类亚群受患者异质性影响较大。但基于本研究样本量相对较小，分析患者特征与细胞功能变化相对困难。
Suppl Fig 3b: 髓系细胞再注释为不同的巨噬细胞亚群、树突状细胞、炎性单核细胞、肥大细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等。

Marker: HLA-DPA1, HLA-DPB1, CD14, CD68, SELENOP, LYZ, C1QA, C1QB, (M0) CD209, CD163L1, FUCA1, MRC1, FOLR2, A2M, PTPRC, IL10RA, KLF4, NRG1, EREG, HBEGF, CD300E, VCAN, FCN1, INHBA, ACOD1, CXCL5, SPP1, MMP9, CLEC5A, S100A8, S100A9, OSM, TNF, IL1A, IL1B, IL6, CCL20, CD1C, TCTN3, LAMP3, CCR7, LAD1, CCL22, CCL19, CCL17, FCGR3B, CMTM2, AQP9, CXCL8, HCAR3, CSF3R, FFAR2, PROK2, CXCR2, CXCR4, CCL3L1, IFIT2, IFIT3, GBP5, GBP1, CLC, IL4, IL13, MS4A3, TPSB2, TPSAB1, LTC4S, MS4A2, CD69, GATA2, TOP2A, MKI67, PCLAF

Fig 2a, Suppl Fig 3c: 髓系细胞再注释及丰度差异。M2特征性标志如CD163L1, CD209, FOLR2；根据巨噬细胞相关基因及M2特征性标志的表达情况将健康对照组巨噬细胞注释为M0和M0_Ribhi，其PTPRC/CD45亦相对低表达。除外M0和M2, 髓系细胞可再注释为ACOD1和CXCR5 M1、IDA巨噬细胞。
Fig 2b: Milo工具分析健康对照和IBD患者髓系细胞构成差异。
Fig 2c: 火山图显示M2和M0巨噬细胞表征基因。
Fig 2d: 热图显示M0, M2, M1和IDA巨噬细胞在HC, CD和UC差异基因的表达。
Fig 2e: Cos Mx SMI显示HC, CD和UC髓系细胞亚群分布。
分析各髓系细胞亚群与肠粘膜间距发现，健康对照组驻留巨噬细胞与粘膜相距最近，肥大细胞和DCs倾向位于更深层次粘膜层，而IBD患者M1巨噬细胞和中性粒细胞可见于粘膜表面即溃疡处。

Fig.2 | Analysis of myeloid cell subsets in healthy and inflamed colonic mucosa.

3. M0 and M2 represent two independent states

Suppl Fig 4a,b: 作者应用上述注释基因对其他公共数据进行HC, CD和UC髓系细胞注释并比对与数据来源注释亚群的相关性，发现M0和M2细胞与来源文献注释最为相近。

Supplementary Figure 4. Intestinal Macrophages across studies

Supplementary Figure 4. Intestinal Macrophages across studies

Supplementary Figure 5. Inflammation-dependent alternative (IDA) macrophages show a unique signature compared to M2 and M1 macrophages

Supplementary Figure 4. Intestinal Macrophages across studies.

Supplementary Figure 5. Inflammation-dependent alternative (IDA) macrophages show a unique signature compared to M2 and M1 macrophages.

4. Inflammation-associated macrophages, including M1 and Inflammation-Dependent Alternative macrophages, show highly heterogeneous signatures among patients

相较健康对照，IBD患者巨噬细胞比例及多样性相对增加。除外M0和M2, 作者发现炎性/活化巨噬细胞可分为至少三种不同状态：M1 (M1 ACOD1和M1 CXCL5)、IDA巨噬细胞和炎性单核细胞。与M0和M2巨噬细胞不同的是，炎性巨噬细胞在不同来源的数据相似性不高，提示其与患者背景高度相关。
Suppl Fig 5c: 采用体外 i) GM-CSF-derived macrophages (Cuevas VD et al., 2022), ii) GM-CSF-derived macrophages stimulated with LPS (Cuevas VD et al., 2022), iii) M-CSF-derived macrophages stimulated with LPS (Cuevas VD et al., 2022), iv) upregulated genes of M-CSF-derived macrophages inhibited with MAF siRNA (Vega MA et al, 2020) and v) upregulated genes of M-CSF-derived macrophages stimulated with 5-HT (serotonin) (Nieto C et al, 2020; Domínguez-Soto Á et al, 2017) 上调基因标注注释细胞，发现M1 CXCL5与体外GM-CSF诱导巨噬细胞相似性较大，而M1 ACOD1与M-CSF和GM-CSF+LPS诱导的巨噬细胞均具有共同表达。IDA巨噬细胞则与M-CSF+ serotonin(5-HT)诱导的巨噬细胞转录特性更为相似。
基于轨迹分析结果，M1亚群发育轨迹与M2/M0不同。炎性单核细胞可完全分化为M1活化状态；然而，IDA巨噬细胞具有M1, M2分支，说明其可能处于上述两种亚群的转换状态。
Suppl Fig 5d, 5e: 韦恩图示IDA巨噬细胞前200个marker基因与M1, M2分别具有10%和16%的共同基因。火山图说明IDA巨噬细胞与M1, M2基因表达差异较大。
本研究说明肠道巨噬细胞可源于单核细胞在不同刺激条件下分化诱导。

Supplementary Figure 5. Inflammation-dependent alternative (IDA) macrophages show a unique signature compared to M2 and M1 macrophages.

5. Inflammation-dependent alternative macrophages express neuregulin 1

Fig 3a: IDA巨噬细胞特征基因包括EGFR家族配体如AREG, HBEGF和NRG1, M1和M2传统标志物相对低表达。
Fig 3b,c: NRG1在UC患者的表达相较CD和HC均明显升高。提示neuregulin 1可能参与IBD, 尤其是UC疾病的发生发展。
Fig 3d: 原位杂交显示IBD患者NRG1与CD68+巨噬细胞共表达。然而健康对照组NRG1的表达多见于上皮细胞，CD68+巨噬细胞表达较少。
Suppl Fig 6a-e: scRNA-seq和Cos Mx SMI分析亦可见正常对照组NRG1多表达于S2b(SOX6+) 肠腔侧成纤维细胞，而非隐窝旁S2a 成纤维细胞。另外成纤维细胞NRG1的表达水平在UC患者亦显著增加。
Fig 3e: Neuregulin 1 可结合ErbB受体诱导人上皮分化成分泌细胞及促进小鼠干细胞的增殖再生。作者应用富含肠上皮干细胞的类器官，发现Neuregulin 1可显著抑制干细胞标志物LGR5并促进OLFM4的表达，其中增殖标志物MKI67未见差异。
Suppl Fig 7a: 考虑NOTCH配体和TNFα均可诱导上皮细胞OLFM4的表达。分析Notch靶基因和受体(NOTCH1-4)在各组上皮细胞的表达，可见HES1和NOTCH1在上皮细胞表达。与HES1相反，NOTCH1在完全分化的上皮细胞表达相对下降。可见TNF受体TNFRSF1A和TNFAIP3在上皮细胞表达。作者进一步通过1000-gene CosMx panel 验证NOTCH1和TNFRSF1A 的空间定位。

Fig.3 | Neuregulin 1 expression and function in colonic mucosa.

6. CosMx Spatial Molecular Imaging analysis confirms the expansion of Inflammation-Dependent Alternative macrophages and reveals their tissue distribution in inflammatory bowel disease colon

Fig 4a: CosMx SMI分析可见IDA巨噬细胞广泛分布与UC和CD患者结肠组织。
Fig 2g: M1巨噬细胞在肠固有层和粘膜下层相对少见，主要分布于溃疡表面。
Fig 4b: 1例CD患者见有肉芽肿。CosMx SMI分析可见IDA和M2巨噬细胞为该肉芽肿的主要组成细胞，少见M0和M1巨噬细胞。免疫组化可见CD68+CD209+M2标志物的表达亦相对少见并分散。
Fig 4c: NRG1在肉芽肿的表达相较固有层巨噬细胞减少。
因此, IDA巨噬细胞NRG1的表达与组织结构相关。NRG1hi IDA巨噬细胞多位于肠腔近上皮处，NRG1lo IDA巨噬细胞见于CD患者肉芽肿或IBD患者粘膜下层。提示两群细胞功能不同。

Fig.4 | Inflammation-Dependent Alternative (IDA) macrophages are widely distributed in ulcerative colitis and present in Crohn’s disease granulomas.

7. Inflammatory fibroblasts co-localize with Inflammation Dependent Alternative macrophages in inflammatory bowel disease

Fig 5a: CD或UC患者IDA巨噬细胞倾向与其他巨噬细胞亚群、部分间质细胞和T细胞（尤其是CD8+T, Tregs, CCL20 T）空间距离靠近。
Fig 5b,c: CD或UC患者IDA巨噬细胞与炎性成纤维细胞具有高度空间相关性。
Fig 5f: 炎性成纤维细胞表达CSF2和CSF3, encoding for GM-CSF, G-CSF respectively, 和前列腺素合成酶PTGS1,PTGES,PTGS2。近年研究表明类风湿关节炎滑膜组织成纤维细胞活化可诱导产生前列腺素并促进IDA样巨噬细胞的分化和HBEGF, EREG而非NRG1的表达。提示炎性成纤维细胞和巨噬细胞可通过配体-受体直接作用参与IBD疾病的发生发展。

Fig.5 | Inflammation-Dependent Associated (IDA) macrophages co-localize with inflammatory fibroblasts.

8. Single-cell RNA sequencing reveals a marked heterogeneity of tissue neutrophils in inflammatory bowel disease colonic mucosa

Suppl Fig 11a-c: IBD患者中性粒细胞及嗜酸性粒细胞比例均明显升高。相较外周血，其特征性表面标志 (CD62L, CD193, CD69) 表达增加，提示存在不同活化状态。
Suppl Fig 3a: 嗜酸性粒细胞特征标志如CLC, MS4A3, CCR3 和 “Th2” 细胞因子 IL4 和IL13。
Fig 2b: 中性粒细胞特征标志如HCAR3, FCGR3B (CD16b), CMTM2, PROK2 等。
Fig 6a: 肠道中性粒细胞可分为3个亚群，命名N1, N2和N3, 其在不同疾病和个体丰度有所差异。相较N1和N3，N2中性粒细胞表达CCL3, LGALS3 和CXCR4 增加，而N3中性粒细胞表达如GBP1, IRF1, FCGR1A等IFN-response signature更明显。
Fig 6c: 与其他外周血中性粒细胞scRNA-seq数据集比较，N1和N3中性粒细胞与骨髓成熟中性粒细胞（BM matureN）和脐带血中性粒细胞（UCB）具有相似性。N2中性粒细胞与外周血中性粒细胞重叠性不高，相反，其特异性表达组织定位相关基因如趋化因子和受体、不同活化状态和功能（如CD83, CD63, FTH1, VEGFA）。
Suppl Fig 11d: 组织中性粒细胞N2标志物CXCR4和CD63 的表达率可达10%和61%，外周血则分别为0.26%和14%。
Fig 6d: Cos Mx SMI分析见上述3类中性粒细胞亚群广泛分布于炎性固有层结构，主要集中于隐窝脓肿和溃疡病变处。

Fig.6 | Analysis of the heterogeneity of neutrophil populations in inflamma tory bowel disease (IBD) colonic mucosa.