种内遗传多样性的系统保护规划

        种内多样性告知了我们种群的数量统计和进化历史，应该成为一个主要的保护目标。虽然一直有办法确定相关生物保护单元（BCU），但试图从种内多样性出发确定优先保护区域的尝试却很少，尤其还是在多物种框架内。我们使用法国加伦河-多尔多涅河流域的6种欧洲淡水鱼(S.cephalus, Ph. phoxinus, B.barbatula, G. occitaniae, L. burdigalensis 和 Pa. toxostoma)的中性分子数据来确定遗传多样性的热点和冷点，并采用系统保护规划方法确定优先保护区域。我们将证明，系统保护规划可以有效确定优先区域，该优先区域可以代表一整个景观的全部遗传多样性的预定义部分。除了私有等位基因丰富度（PA）以外，经典的遗传多样性（等位基因丰富度，遗传独特性）并不能很好地预测识别优先区域。此外，我们发现每个物种的保护方案之间替代性较差，这意味着保护方案具有高度的物种特异性。尽管如此，我们发现，与使用单一物种或是基于传统分类准则相比，多个物种的种内遗传数据确定的优先区域可以提供更有效的保护方案。

1. 背景

        通常可以通过确定具有高度生物多样性和/或景观价值的保护区域来实现生物多样性保护。保护区域一般认为是地方特有、稀有或标志性物种比例高的区域。或者，保护规划也可以基于保护区域的互补概念，以及基于成本效益分析，比如系统保护规划程序（SCP）。SCP的目标是确定一些互补的和不可替代的地点，这些地点最能代表预定比例的一个地区能观测到的生物多样性，并且应该以最低的成本优先进行保护管理。将物种进化历史考虑进保护计划这一提倡的重要性已经实现了概念和操作上的重大飞跃。例如，一些作者在SCP中包含了物种组合的系统进化历史，以同时保存物种本身和它们的宏观进化史。然而，在种群水平（物种内）观察到的遗传多样性很少被考虑到SCP中。种内遗传多样性（IGD）是生物多样性的一个基本方面，因为它传达了种群的数量统计和分布历史（即有效种群大小随时间和空间的变化）、生物连通性水平以及适应环境变化的潜力等相关信息。保护遗传学家通常使用中性遗传多样性（即不受适应过程影响的基因组部分）来识别物种中的相关进化单元，主要是通过分析群体间的遗传分化来实现的。例如，“进化显著单元”框架已被提出，以确定不同谱系的保护优先次序。通过强调互补性，而非差异性，SCP成为了前景巨大的互补框架，可以确定地点的最优集合，用以保存在景观中观察到的IGD量的预定义数量。

        大部分SCP研究尚未考虑到IGD这一旨在识别要保护的遗传多样性的有效替代品的方案。例如，最近的两项研究表明，利用传统物种分布数据以及环境和地理描述确定的保护区域可以在保护规划中作为IGD的有效替代。虽然这些研究阐明了SCP如何帮助保存多个物种的IGD，但只有少数研究直接将多物种的基因型数据用于SCP。使用中性共显性遗传标记如微卫星标记生成的数据集和通常用于SCP的数据集（存在缺失矩阵）很相似，因此可以不需要中间建模程序或者计算总结遗传统计数据（这些可能无法获取种群的整个IGD）,就将基因型调查应用于SCP。

        在这里，我们测试了由在景观尺度上一个物种集合的IGD识别出优先保护区域的SCP方案的潜力。我们首先考虑了一组四种常见淡水鱼（鲢鱼S. cephalus，白杨鱼G. occitaniae, 石泥鳅B. barbatula和鲦鱼Ph. phoxinus）以测试保护目标（不可替代地点所能保护的IGD占总量的比例）和分析策略（单独分析每个物种还是集中分析所有物种）对最终保护方案（不可替代地点的数量和质量）的影响。然后，我们将两种具有特殊保护价值的稀有物种（L. burdigalensis 和Pa. toxostoma）纳入研究，以测试SCP方法在一项“真正的以保护为导向的研究”中的相关性。对于所有的物种，我们就同一个典型保护目标进行SCP分析，探究河流景观中不可替代地点的空间分布，并测试物种间不可替代地点的替代性。我们进一步测试了使用SCP确定的不可替代的地点是否能比随机选择的地点或使用传统分类标准选择的地点（例如显示高度物种丰富度的地点）更有效地保存IGD。最后，我们测试了是否能用经典遗传多样性指数正确地预测不可替代地点。我们证明了使用系统保护规划来保护一个物种集合的IGD是有效的，虽然方法复杂，需要适当的分析来协助决策。

2. 材料和方法

（a） 生物模型

       我们专注于六种淡水鱼：S. cephalus,Ph.phoxinus,B.barbatula, G. occitaniae,L. burdigalensis 和Pa. toxostoma，前三广泛分布于欧洲，后三法国南部特有。除了B.barbatula 属于Nemacheilidae科，其余物种都属于Cyprinidae科。本物种组合覆盖了代表许多淡水鱼群落的大型功能特征空间。例如，S.cephalus体型庞大、寿命长（可以活到60cm之长15年之久），而Ph. Phoxinus体型小、寿命短（只有12cm不到，4-5年寿命）。从生态角度看，Pa. toxostoma,B.barbatula,G. occitaniae生活在底层，而S. cephalus和Ph. phoxinus生活在整个水体。L. burdigalensis则更投机一些。此外，B.barbatula主要在夜间活动，其他种类则在白天活动。这些物种里有四种是广泛分布的（S. cephalus,G. occitaniae,B.barbatula和 Ph.phoxinus），虽然它们在加伦河-多尔多涅河流域的生态位和空间占用有所不同。下文我们将视这一组物种为“常见”。另外两种分别是稀有（L. burdigalensis）到格外稀有（Pa. toxostoma），具有特别保护价值。L. burdigalensis是一种最近才被描述的物种，在许多种群中都经历了种群数量和遗传上的瓶颈。Pa. toxostoma已被列入国际自然保护联盟的红色名录、欧盟栖息地指令的附件二和伯尔尼公约的附录三。

（b）采样设计

       在2010-2011的春夏，我们使用电钓技术对横跨整个欧洲河流流域（加伦河-多尔多涅河流域，法国西南部，超过十万平方公里）35条河流的92个地点进行采样。选取的采样点覆盖了河流景观中各物种的全部分布，以表征其IGD的空间格局。每个地点每个物种最多尽可能采样到25个个体。并不是所有的采样点都存在有所有的物种，而且由于密度低，也不是所有的采样点都能提供每个物种25个个体。在这些情况下，我们尽可能多地捕获。我们对每只鱼进行麻醉，然后收集它们的腹鳍碎片并储存在90%的乙醇中。

（c）基因分型

       基因组DNA的提取使用盐提取协议。使用多路聚合酶链式反应扩增了8-15个微卫星位点（G.occitaniae 8个，B.barbatula 9个，S.cephalus和Ph. phoxinus 10个，L. burdigalensis14个，Pa. toxostoma 15个）。

（d）遗传多样性评估

       由于对常见物种的采样良好，因此对这些物种显示最小样本为10个个体的采样点进行描述性遗传分析，以最大限度地保证随后基于等位基因频率的遗传分析的一致性。对于两种稀有物种，采样更受限制，对显示最小样本为6个个体的采样地点进行遗传分析，以使SCP中包含的采样地点数量最大化。将最小样本量从10个减少到6个，可大大增加用于遗传分析的地点的数量（L.burdigalensis从21个地点增加到29个地点，Pa. toxostoma从8个地点增加到14个地点），因此提高了它们的空间分布的代表性。然后，我们确定了所有6个物种的零等位基因的发生，潜在的评分错误，偏离哈迪-温伯格平衡和连锁平衡的位点。

       为了评估地点内IGD （α-IGD），我们使用ADZE中实施的稀疏程序来计算每个采样地点的等位基因丰富度(AR)和私有等位基因丰富度(PA)（考虑到常见物种至少有n=10个个体，稀有物种至少有n=6个个体）。为了评估地点间IGD(β-IGD)，我们使用R包mmod计算每个物种的两两遗传分化指数（Dest）。对于每个地点（和物种），我们然后推导出在一个给定地点和所有剩余地点之间两两配对的所有Dest值的平均值，从而得到每个地点的单一值。对于稀有物种，考虑n≥6个体而不是n≥10个体的地点对AR、PA和Dest的影响较低（对PA和Dest均无明显影响，至于AR对于Pa. toxostoma 和L.burdigalensis，平均每个地点减少0.295和1.183个等位基因）。然而，当考虑到n≥6个个体的地点时，这种影响被保留的稀有物种地点数量的增加所过度补偿。

（e）测试使用种内遗传多样性的系统保护计划程序的适宜性

       在这第一步中，我们测试了保护目标和分析策略对保护方案的影响。我们主要关注来自四种常见物种的数据，因为它们在采样区域的大范围覆盖更适合在此步骤中进行演示练习。

（i）种内遗传多样性的空间模式

       我们首先使用地理统计建模工具，通过对空间水系网络的广义线性模型（GLMSSN），从观测到的经验值预测AR、PA和Dest的分布，来探索河流景观中四种常见物种a-和b-IGD的空间模式。这些模型是通过假设三个地理描述 (即到出水口的拓扑距离，经度，纬度)作为解释变量来构建的。我们使用最佳模型（通过AIC模型获得）的预测来生成每个常见物种和每个遗传指数的克里金图。这使我们能够在整个河流流域中表示IGD的空间分布，从而在视觉上突出IGD的热点和冷点。最后，我们计算了每对常见物种在各个地点上计算的AR、PA和Dest值之间的Pearson相关系数，以检验物种间IGD模式的空间一致性。

（ii）识别不可替代地点

       我们测试了保护目标（在保护方案中存在的保护单元总数的百分比）和分析方法（物种单独分析或是物种混合分析）对不可替代地点识别的影响。传统上SCP方法使用物种存在/缺失数据作为输入数据，以确定不可替代的地点（不能排除在最佳保护地点选择之外的地点），从而在群落水平上保护分类学多样性。在这里，我们用等位基因存在/缺失数据代替物种存在/缺失数据，就像在文献[11]中那样，以确定在河流景观上每个物种的IGD保存中不可替代的地点。我们利用马MARXAN v. 2.1和来自常见物种的基因型数据，在物种水平上确定了一组最优位点，分别以最小的成本至少能代表整个河流景观中存在的等位基因总数的50、75、90或100%。然后，我们可视化测试和比较了不可替代地点在物种和保护目标之间的比例如何变化。

       为了测试来自多个物种的混合数据如何影响不可替代地点的识别，我们进一步进行了混合分析，即在一个地点上发现的每个常见物种的所有等位基因都汇集在一个输入数据集中。然后，我们随机抽取河流景观水平上存在的等位基因总数的30、50、75、90和100%（所有常见的物种都被混合了），并对每个保护目标进行100次MARXAN运行，以确定代表这些特定等位基因选择的最小地点集合。

（f）一个使用SCP的真正的以保护为导向的研究

       在这第二步中，我们（1）探索了不可替代地点的空间分布，（2）测试为每个物种找到的保护方案在物种之间是否一致，（3）测试为一个物种找到的保护方案是否可以作为其他物种的替代品，（4）评估我们确定的不同保护方案对所有物种整体IGD的保护效率，（5）比较使用SCP识别出的保护方案和基于传统分类标准（比如物种丰富度高的地点）的替代保护方案的效率，最后（6）检验经典遗传多样性指数是否能正确预测不可替代地点。在这个步骤中，我们包含了两个稀有物种，因为替代性对于测量很难收集数据的稀有物种非常重要。因此，我们更关注常见物种和稀有物种的比较。

（i）识别遗传保护的不可替代地点

       在这里，我们只关注为90%的目标所确定的不可替代地点，并使用上文所述的MARXAN程序来分别为L. burdigalensis和Pa. toxostoma确定这些地点。然后我们将这些不可替代地点映射到河流网络上以测试（1）是否特定地域拥有更多的不可替代地点（例如上游区域通常被认为具有高保护级别）和（2）是否在物种之间不可替代位点在空间位置上是一致的，尤其是在常见和稀有物种之间。此外，我们还建立了广义线性模型（GLMs），以90%目标上的不可替代地点为二项式因变量，以地点到出水口的距离和各点间中心值为解释变量。中心值是量化各采样点在河流景观中位置重要性的指标。我们假设二项误差项分布，并在α=0.05阈值下测试每一项的显著性。

（ii）物种间不可替代地点的替代性

       我们通过计算一个物种被另一个物种确定的不可以替代地点所保护的等位基因占其等位基因总量的百分比来估计替代性。虽然我们对所有物种两两之间都计算了替代性，但我们重点关注稀有物种，主要是通过计算（1）稀有物种被所有常见物种确定的不可替代地点所保护的等位基因占总量的百分比，（2）常见物种被所有稀有物种确定的不可替代地点所保护的等位基因占总量的百分比。

（iii）评估系统保护规划程序的有效性

       本分析的目的是（1）评估SCP在保护河流景观中6个物种的IGD整体水平方面的效率，(ii)比较基于SCP的保护方案与基于传统分类学标准的替代保护方案的效率。首先我们计算出保护遗传多样性的平均累积曲线，通过估算随着随机选择的取样地点累加，所能保护的等位基因总数的平均累积百分比。具体来说，我们将采样地点的数量以一个连续的增量从1增加到92。在每个递增的步骤中，我们随机选择地点（不替换），并计算由随机地点集合所能保护的等位基因总数（在所有物种中的）百分比。我们将这种随机选择重复了1000次，并平均了这1000次的百分比，得到了保护遗传多样性的平均累积曲线。然后我们测试了在相同数量的地点上，通过SCP（不可替代地点）确定的保护方案能多大程度上比随机选择的地点保护更高比例的IGD。值得注意的是，我们还探讨了一些特定的保护方案（单一物种、常见物种集合、稀有、所有6个物种确定的不可替代地点）是否能比其他方案更有效地维持较大比例的IGD。

       在大多数保护研究中，物种多样性是主要的保护目标，最终我们基于分类学标准来检验保护方案保护6个被研究物种的整体IGD的有效性。具体地说，我们计算被保护的等位基因总数占比（在所有物种中），通过（1）同时有等于或大于10,15或20种淡水鱼类出现的地点（整个河流景观中被发现的鱼类数量达到了34种，平均12.77±0.55），和（2）六个物种都出现的地点。我们最终将基于分类学数据和基于SCP的保护方案进行效率上的对比，以评估基于分类学标准的保护方案是否可以很好地替代所有物种的IGD。我们从[37]中获得了92个采样点中的81个采样点的鱼类物种发生数据。

（iv）不可替代地点与遗传多样性指数的关系

       为了测试经典遗传指数预测地点为不可替代地点的能力，我们对每个物种运行了GLM（考虑二项误差项分布），以在90%的目标上是否被认为为不可替代位点作为二项因变量，以AR、PA、Dest为解释变量。在α=0.05的阈值下测试每一项的显著性。解释变量被集中以比较物种间预测因子的相对强度。

3. 结果

（a）描述性统计

       总的来说，Pa. toxostoma显示了最低的地点间IGD估计值。AR的平均值从Pa. toxostoma的2.2114到Ph. phoxinus的5.821，PA的平均值从Pa. toxostoma的0.036到L. burdigalensis的0.162。Pa. toxostoma还显示出了最低的Dest平均值（0.069），而B. barbatula的Dest平均值最高（0.383）。

（b）测试种内遗传多样性的系统保护计划程序的适宜性

（i）种内遗传多样性的空间模式

       IGD的空间模式在常见物种间差异较大，很不一致（图1）。例如，S. cephalus的AR值热点地区主要集中在河流景观的西部和核心河道上，而这一地区被认定为是B. barbatula的AR值的冷点区域（图 1a(i)-a(iii)）。无独有偶，G. occitaniae和Ph. phoxinus的PA热点区域呈现负相关（图 1b(ii)-b(iv)）。Dest也得到了类似的结论（图1c）。例如，B. barbatula和Ph. phoxinus的Dest热点区域在河流景观中相对（图 1c(iii)-c(iv)）。因此，GLMSSNs解释变量的符号、斜率和显著性在物种之间存在显著差异（图1）。物种间IGD空间格局的这种不一致性也反映在所有可能的物种两两间的低至中相关系数和各遗传多样性指数上（AR、PA、Dest）。事实上，除了两个比较（AR值的B. barbatula/G. occitaniae和Ph. phoxinus/B. barbatula）外，所有比较的Pearson相关系数都低于0.6。

（ii）保护目标和分析策略对识别遗传保护的不可替代地点的影响

       当我们单独分析物种的时候，发现不可替代地点的数量随着保护目标的增加而增加，在保护目标超过75%等位基因总数时有一个剧升（图2）。然而，不同物种间不可替代地点的百分比存在较大差异。例如，当保护目标为90%时，不可替代地点的比例从G. occitaniae的3.61%到Ph. phoxinus的28.57%。当需要保护100%的等位基因时，不可替代地点的比例从G. occitaniae的25.30%到Ph. phoxinus的68.26%。

       将四种常见物种的等位基因混在一起集中分析时，我们同样发现不可替代地点的比例随保护目标增加而增加（图2）。有趣的是，当保护目标为30%时没有不可替代地点被识别，当保护目标为50%时只有3个不可替代地点被识别（图2）。当保护目标为75%时不可替代地点的比例缓慢增加到17.39%，然后在保护目标为90%和100%时急剧增加到55.70%和76.08%（图2）。这之后的结果表明，当采用混合分析策略时，为了达到较高的保护目标，几乎所有的河流景观都应该得到保护。

（c）一个使用SCP的真正的以保护为导向的研究

（i）识别遗传保护的不可替代地点

    首先我们可视化了不可替代地点的空间分布。总的来说，不同物种在河流景观中不可替代地点的定位差异较大。我们未能为任何物种确定其不可替代地点的聚集区域（如上游/下游）。这种明显的聚类缺失也得到了GLMs在统计学上的证实。事实上，采样点距出水口的距离和采样点间的中心值都不是这些物种不可替代地点的显著预测因子，除了一个，在物种Ph. phoxinus显示出与出水口的距离有显著影响。

    其次，我们测试为不同物种找到的保护方案在物种间是否空间一致。在所有6种鱼类中，当至少有一种鱼类达到90%的保护目标时，42个地点（45.65%）是不可替代的（图3）。这42个地点中，32个地点是在至少一个常见物种里不可替代（图3），14个地点是在至少一个稀有物种里不可替代（图3）。在这6种鱼类中，42个地点里只有8个地点是在至少2个物种里不可替代，只有1个地点是在至少3个物种里不可替代（图3）。

（ii）不可替代地点在物种间的替代性

    替代水平一般较低或中等，而且在物种两两之间差异较大。例如，为G. occitaniae识别出来的不可替代地点未能保护稀有物种的IGD，而且只覆盖了其他常见物种等位基因总数的18~43%。这表明，为G. occitaniae（分布最广的物种）识别出的不可替代地点是保护其他物种IGD的不良替代品。相反，为Ph. phoxinus和L. burdigalensis识别出的不可替代地点能更好替代G. occitaniae，Ph. phoxinus和L. burdigalensis识别出的不可替代地点分别可以覆盖G. occitaniae等位基因总数的79.58%和70.27%。