如何高效富集提取较大量尿液样本中的低丰度 DNA?

操作步骤

1. 请自行准备:无水乙醇、异丙醇、1.5mL 灭菌洁净离心管、10mL 灭菌洁净离心管、10mL 无菌注射器。

2. 取出洗涤液,按终浓度 70%的比例加入无水乙醇,如 3mL 加入 7mL 无水乙醇;15mL 加入 35mL 无水乙醇,充分混匀。

3. 取 10mL 灭菌洁净离心管,加入 2mL 尿液样本、2mL 裂解液、4μLDNAConc.及 60μL 消化液,振荡混匀,65℃水浴 15 分钟。

4. 加入 5mL 异丙醇,轻轻颠倒混匀,如有半透明悬浮物,不影响 DNA 的提取与后续实验。

5. 将富集吸附柱放在抽滤装置上,再将 10mL 无菌注射器针筒插入富集吸附柱上端,将上述溶液转入针筒内,静置 2 分钟,真空抽滤至富集吸附柱内液体刚刚抽滤完毕(约 2-10 分钟,注意不要抽滤太干,太干不利于后续步骤开展)。

6. 向针筒内加 1mL 洗涤液,静置 2 分钟,真空抽滤至富集吸附柱内液体刚刚抽滤完毕(约 1-5 分钟,注意不要抽滤太干,太干不利于后续步骤开展)。

7. 向针筒内加 0.5mL 洗涤液,抽滤 2 分钟。

8. 按每份样本 30μL 取洗脱液(如 10 份提取样本,即取 300μL 洗脱液),放置于灭菌 1.5mL 离心管,65℃预热。

9. 将富集吸附柱放入收集管内,12,000 rpm 常温离心 2 分钟,离去残留的洗涤液。

10. 取出富集吸附柱,放入新的 1.5mL 灭菌洁净离心管内,加入 30 μL 预热的洗脱液,静置 2 分钟,12,000 rpm 常温离心 2 分钟,收集 DNA溶液。提取的 DNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。

特别说明: 

1.本试剂盒配套 BIOG 真空核酸提取装置使用,可提取 2mL 之内量的尿液 DNA,研究者可根据实验需要选择适当量的样本进行提取,所用试剂需按比例调整。

2.洗涤液最好现用现配,按需计算用量后配制。加入乙醇后的洗涤液如使用不完,2-8℃密封保存不超过 1 周。

3.在裂解液刚刚抽滤完毕后,应立即加入洗涤液,以防滤膜干燥。

4.裂解液、洗涤液含有刺激性化学物质,操作过程请做好防护措施,避免直接接触皮肤,防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛,请立即用清水或生理盐水冲洗。5.裂解液、洗涤液如有白色絮状物析出属正常现象,置于 37℃水浴中溶解即可。

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