一、原理
双层琼脂平板法（Double-layer Agar Plate Method）是一种常用的细菌、尤其是噬菌体（bacteriophage）检测方法。该方法的原理基于噬菌体可以特异性侵染细菌宿主，并引起细菌裂解。通过在琼脂平板上使用两层不同浓度的琼脂，噬菌体会在其中形成透明斑点（噬菌斑，plaque），代表噬菌体侵染并裂解细菌的区域。
具体过程包括以下几步：
下层琼脂：下层是较硬的基础琼脂，用于固化支撑整个平板。
上层琼脂：上层是较软的琼脂，一般含有宿主细菌和噬菌体，用于使噬菌体可以在软琼脂中扩散并感染细菌。
当噬菌体侵染细菌后，裂解细菌宿主细胞，形成可见的透明噬菌斑。每个噬菌斑代表一个噬菌体颗粒在起初的感染和裂解过程。
二、方法
制备下层琼脂：将较高浓度（1.5-2%）的基础琼脂液体倒入培养皿，待其凝固。
准备细菌培养物：在液体培养基中培养宿主细菌，通常要生长到对数期（OD值大约为0.6-0.8），此时细菌处于活跃增殖阶段。
混合噬菌体和宿主细菌：在一个小管中，将噬菌体溶液和宿主细菌混合。
上层琼脂的制备与倒置：加入已经混合好的噬菌体和宿主细菌溶液到已融化并冷却至约45℃左右的软琼脂（0.7%琼脂），并快速倒在已经固化的下层琼脂上，使之均匀分布。
培养：将双层琼脂平板在适宜温度下（通常为37℃）培养16-24小时。噬菌体会在培养的过程中侵染并裂解细菌，形成噬菌斑。
观察结果：培养结束后，观察透明噬菌斑的形成，计算噬菌体的数量（用噬菌斑单位，PFU，plaque-forming unit表示）。
三、应用
噬菌体的分离与纯化：双层琼脂平板法可用于从环境样本（如水、土壤或粪便）中分离特定噬菌体。通过对不同宿主细菌的选择性侵染，分离出特定的噬菌体株。
噬菌体滴定（计数）：通过稀释噬菌体溶液并在平板上进行培养，可以计算噬菌体的浓度（PFU/mL）。这是噬菌体研究和生产中常用的方法。
噬菌体裂解活性的检测：用于检测特定噬菌体对宿主细菌的裂解活性，尤其是研究抗菌治疗中的噬菌体疗法时，通过观察噬菌斑的形成来评估噬菌体对细菌的杀灭效果。
噬菌体宿主范围的研究：通过使用不同种类的细菌宿主，用双层琼脂平板法可以研究噬菌体的宿主范围，了解噬菌体对不同细菌的特异性。
基因重组研究：通过噬菌体介导的转导过程研究细菌中的基因重组机制，常用于分子生物学实验中。
双层琼脂平板法在微生物学、病毒学及生物技术研究中具有广泛的应用，是研究噬菌体及其与细菌宿主相互作用的关键技术之一。
