PCR引物设计大法

引物是PCR成功的关键因素之一，虽然PCR的稳健性很强，有时让人觉得似乎随便用什么引物都能扩增出来，但是精心设计的引物能够明显提升PCR的成功率，如果你经常做PCR，这能为你省去很多重复实验的麻烦。

本文基于《Methods In Molecular Biology》的“PCR Primer Design”系列文献，冷泉港“PCR Primer Design”操作规程和引物设计生信工具综述，来聊聊引物设计的一般原则。

《Methods In Molecular Biology》是Springer出版的分子生物学方法学系列著作，涵盖了生物学的方方面面，是经典中的经典，它是一本论文集，目前已经更新到2126卷，我收集了1-1252卷，时间跨度从1984-2015，每卷包括10-20篇该领域的高水平论文。其中402卷为“PCR Primer Design”系列，涉及不同类型PCR引物设计的原则、算法、工具等。

冷泉港Protocols在分子生物学领域具有重要的地位，被很多科研人员所推崇，PCR Primer Design来自于2009年第3卷（doi:doi:10.1101/pdb.ip65），简述了PCR引物设计的影响因素和不同类型PCR引物设计的基本策略。

Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design(10.5897/AJB2003.000-1019)

《Methods In Molecular Biology》的建议
$\color{#FF3030}{Physical\ Principles\ and\ Visual-OMP\ Software\ for\ Optimal\ PCR\ Design}$
文章主要介绍了PCR引物设计的物理原理和他们设计的Visual-OMP软件的特点，并且介绍了七种关于PCR的谜题及改进方法，要点如下：
①PCR Nearly Always Works and Design Is Not that Important
②Different Methods for Predicting Hybridization Tm Are Essentially Equivalent in Accuracy
Tm对引物十分重要，有很多预测寡核苷酸Tm的方法，他们的准确性基本相同。
③Designing Forward and Reverse Primers to Have Matching Tm’s Is the Best Strategy to Optimize for PCR
很多人认为上下游引物具有接近的Tm对PCR的成功有很大帮助，但要注意在比Tm低的温度（Tm - 5~10℃）退火时，Tm相同的引物与模板的杂合状态也是不同的。

左图：引物A和引物B的Tm在68.6℃处相交，但两者的斜率不同（这与引物序列、GC%有关），如果取58℃退火，引物B结合87％，引物A结合97％，这将导致不平等的杂交和聚合酶延伸，从而降低PCR效率。右图：改进后的设计策略，根据退火温度下的自由能平衡设计引物，而不是根据Tm平衡设计引物，这种方法上下游引物的Tm可能是不同的。

④“Primer Dimer” Artifacts Are Due to Dimerization of Primers
容易形成引物二聚体的因素有：高循环数（>35）有利于形成二聚体，掺入外源基因组DNA，引物结合靶DNA的效率较低，使用具有校正活性的DNA聚合酶（Pfu等）因3'外切活性可能使原本不匹配的3'端互补。
⑤A BLAST Search Is the Best Method for Determining the Specificity of a Primer
⑥At the End of PCR, Amplification Efficiency Is Not Exponential Because the Primers or NTPs Are Exhausted or the Polymerase Looses Activity
PCR扩增具有特征性的“ S”形，有人认为平台期的成因可能引物或dNTP消耗殆尽，事实上平台期的引物和dNTP余量都很富裕，真正导致平台期的原因是积累的dsDNA产物的抑制，这已经得到了实验证明。（使用一些DNA双链结合蛋白是否能减轻这种抑制？比如Sso7d）
⑦Multiplex PCR Can Succeed by Optimization of Individual PCRs

Multiplex PCR optimization guidelines suggested by Henegariu et. al(1997)

$\color{#FF3030}{Selection\ for\ 3'End\ Triplets\ for\ Polymerase\ Chain\ Reaction\ Primers}$
作者从VirOligo（VirOligo是病毒特异性寡核苷酸的数据库，包含用于检测病毒核酸的PCR引物和杂交探针及对应的实验条件）选取大量的引物序列，统计了他们的序列长度、Tm范围、GC含量等指标，重点研究了他们3'端三联体碱基与PCR成功率的相关性，得出一些特定的三联体有助于获得好的PCR结果，要点如下：
①如果允许，应该优先选择WSS（W=A/T，S=C/G）、SWS、TTS作为3'端序列，但要避免这些三联体中包含CG；
②如果选不到合适的，应优先选择NNS；
③尽量避免WWW、CGW、GGG。
冷泉港的建议
文章介绍了进行引物设计要考虑的一般因素，如长度、Tm、GC%、二级结构、重复序列，重点讨论了多重PCR、巢式PCR、TaqMan探针、分子信标引物设计的注意事项与策略，没有建设性建议：
①长度：18-33nt
②引物Tm：55-60℃
③扩增子Tm：>92℃
④末端2bp最好为GC
⑤避免poly序列，避免三个及以上的G
PCR引物设计工具与指南
文章介绍了大量PCR引物设计在线工具和软件，并综述了引物设计的一般准则：
①引物长度：18 - 30nt
②熔解温度：52 - 58℃
③GC含量：45％ - 60％
④3'-末端序列：G/C
⑤二聚体：尽量避免互补性或回文序列
⑥特异性：尽量避免错配

综上所述，我把普通PCR引物设计的一般原则总结如下：
①长度：18-26bp，可放宽至18-30bp（有研究表明超过30bp再增加引物长度意义不大）；
②Tm：54-58℃，可放宽至52～62℃，GC%>60%可进一步放宽，重点是上下游Tm要保持平衡（∆Tm = -3～3℃）；
③3'端：优选三联体WSS、SWS、TTS，二连体GC，单体S，尽量规避WWW、CGW、GGG、CG；
④GC%：40% - 60%，可放宽至30%-70%；
⑤其他：避免3'端8bp及以上序列与模板多位点互补，尽量避免上下游3'端4bp及以上反向互补，尽量避免内部回文。

基于上述原则，怎么在实践中应用呢？我认为得分为两种情况：
①基因克隆PCR引物设计
这种情况我们往往并没有太多选择，只能从ATG开始，从TAA等结束，什么GC%、二聚体和错配，可能根本由不得我们。既然起点定了，那只能通过改变长度来匹配最优设计要求了。
②鉴定PCR引物设计
我们只需要确认一段DNA序列上的一部分，起点是相对的，我们可以在整个序列范围内搜索，引物设计的灵活性大大提高，当然搜索时间也要增加。

无论哪种情况，如果我们手动搜索都要花费大量时间，因此最好的办法是通过计算机程序来实现（第一种情况）。

首先：在所有指标中，只有长度可以作为自由的自变量，Tm、GC%、3'端都与之相关，可以作为我们的统计指标，构建一个评分函数：f（x）= k₁×φ₁（Tm）+k₂×φ₂（GC%）+k₃×φ₃（3'NNN）

然后：来建立这三个指标的评分标准

Tm评分标准

Tm	得分
<48℃	10
48℃-52℃	30
52℃-55℃	70
55℃-58℃	100
58℃-62℃	80
62℃-68℃	40
>68℃	20

GC%评分标准

GC%	得分
<20	0
20-30	20
30-40	50
40-50	100
50-60	100
60-70	60
70-80	20
>80	0

3'端三联体评分标准（根据Onodera的统计结果，拿每个三联体与最小值的差/极差×100）

三联体	得分	三联体	得分	三联体	得分	三联体	得分
AGG	100	CAT	48	ACA	36	CGC	24
TGG	88	GAG	47	CCA	34	CTT	24
CTG	84	TGT	47	CCG	34	GCG	23
ACC	81	ATG	44	TAC	34	TCG	23
TCC	81	AGT	42	GTA	32	CCT	21
CAG	80	GGC	42	ACG	31	CTA	21
AGC	75	GAC	40	TCA	31	GTT	21
GTG	72	GAT	40	TGA	31	TTT	19
TTC	72	AAG	39	CAA	29	ATA	18
CAC	68	CCC	39	CGG	29	TAT	18
TGC	67	GGA	39	AAT	27	GGG	14
CTC	59	ACT	37	GAA	27	ATT	11
GTC	57	GCA	37	GCT	27	CGT	11
TTG	52	GCC	37	GGT	27	CGA	8
AAC	50	TAG	37	TCT	26	TAA	6
ATC	50	AAA	36	AGA	24	TTA	0

系数的权重

系数	k₁	k₂	k₃
数值	5	2	3

Tm计算公式
关于引物Tm的计算，我在之前的文章PCR退火温度预测做过详细介绍，我们采用von等（von Ahsen N, 2001）的公式：
Tm = 77.1 + 11.7×lg（[Na⁺] + 120 * ([Mg²⁺] - [dNTPs])^1/2） + 41×GC%- 528/n - 0.75×5（DMSO）
式中GC%代表引物的GC比例，n代表引物长度，5（DMSO）代表5%的DMSO添加剂。

一般，聚合酶Mix中Na⁺浓度为50-100mM，Mg²⁺为1.5-2.5mM，dNTPs为0.8-1mM，我做了一个估算，这个范围内的离子强度变化仅导致2℃上下的浮动，基本可以忽略。大多Mix添加了防冻剂，防冻剂基本上都是多羟基化合物，这些多羟基化合物容易降低水活度从而降低退火温度，不过因种类和浓度的不同对Tm的影响不同，这里用4℃作一般校正，因此该公式可以简化为：
Tm = 64 + 0.41×GC - 528/n

算法的核心流程
①选取18-30bp的长度范围，以最低长度18bp为生长点，逐渐延长至30bp。
②对于每次生长循环，使用该引物3'端8bp进行全局搜索，如果出现一个以上的配对，直接pass。
③计算并记录每条引物的得分、序列和Tm，采用数组。
④将上游引物数组和下游引物数组分别按得分从高到低进行排序。
⑤引物对匹配，原则上选取引物对总得分最高的，但是必须考虑Tm平衡的问题。我的策略是：从上游最高得分引物开始，依次匹配下游引物，要求优先匹配|∆Tm|<=3℃的引物对，一旦匹配终止本次循环，从上游第二条继续，如果直到筛选结束都没有满足要求的引物对，直接选择上下游最高得分引物作为引物对；
⑥经过步骤⑤，得到的可能是一对引物也可能是多个引物对，而且大多时候是多个。如果只有一对引物，那只能直接输出了。
⑦如果是多个引物对，先按总得分从高到低排序，检查引物对的互补性，如果互补率（互补碱基数/最长碱基数）>50%，继续下一对检测，直到互补率<=50%即可输出，如果全部不满足要求，直接输出总得分最高的引物对。

效果评价
我把完整的代码放在了：http://www.liuzhen106.com/tools/101.html

设计示例

我用绿色荧光蛋白（GFP）做了测试，结果上游输出一条20bp、Tm=59℃的引物，下游为28bp、Tm=57.5℃。长度差异比较大，好像看起来不大聪明的亚子，我用Snapgene分析了下GFP的序列，它正向30bp的GC%比反向高得多，这是导致长度不平衡的根本原因。我修改了程序，让它把上下游18-30bp全部输出（上游引物自动越过了18bp、19bp，他们末端8-9bp有内部结合位点），经过人工匹配，这确实是最优的引物对。

看来它还是能解决些问题的，针对复杂的序列，我没有指定特殊处理规则，因此程序健壮性不高，不过这样的序列，还是按自己的经验比较好。

核心代码示例

//匹配最佳引物对
function pairing(oliog_Fs,oliog_Rs) {
    var pairs = new Array();
    for (i=0; i<oliog_Fs.length; i++) {
        var score_f = parseInt(oliog_Fs[i].split(",")[0]);
        var oligo_f = oliog_Fs[i].split(",")[1];
        var tm_f = parseFloat(oliog_Fs[i].split(",")[2]);
        for (j=0; j<oliog_Rs.length; j++) {
            var score_r = parseInt(oliog_Rs[j].split(",")[0]);
            var oligo_r = oliog_Rs[j].split(",")[1];
            var tm_r = parseFloat(oliog_Rs[j].split(",")[2]);
            if (Math.abs(tm_f - tm_r) <= 3) {
                var score = score_f + score_r;
                var text = "0000".slice(String(score).length) + String(score) + ',' + oligo_f + ',' + oligo_r + ',' + tm_f.toFixed(1) + ',' + tm_r.toFixed(1);
                //继续判断互补性
                        var length_temp = Math.min(oligo_f.length, oligo_r.length);
                if (comp(oligo_f, oligo_r) / length_temp <= 0.5) {
                    pairs.push(text);
                    break;
                }
            }
        } 
    }           

    if (pairs.length < 1) {
        score_f = parseInt(oliog_Fs[0].split(",")[0]);
        var oligo_f = oliog_Fs[0].split(",")[1];
        tm_f = parseInt(oliog_Fs[0].split(",")[2]);
        score_r = parseInt(oliog_Rs[0].split(",")[0]);
        var oligo_r = oliog_Rs[0].split(",")[1];
        tm_r = parseInt(oliog_Rs[0].split(",")[2]);
        var score = score_f + score_r;
        var best = "0000".slice(String(score).length) + String(score) + ',' + oligo_f + ',' + oligo_r + ',' + tm_f.toFixed(1) + ',' + tm_r.toFixed(1);
    }else {
        pairs.sort().reverse();
        var best = pairs[0];
    }
    return best;
}

//引物（集合）搜索
function primer(sequence, length) {
    var oligos = new Array();
    for (i=18; i<length; i++) {
        var oligo = sequence.slice(0, i);
        var Tm = tm(oligo);
        var GC = gc(oligo);
        var triplet = oligo.slice(-3);
        var str = oligo.slice(-8);
        var pattern = new RegExp(str, "g");

        var tempSeq = sequence + 'N' + rev_com(sequence);
        if (tempSeq.match(pattern).length > 1) {
            continue;
        }else {
            if (Tm < 48) {var score1 = 10;}
            else if(Tm < 52) {var score1 = 30;}
            else if(Tm < 55) {var score1 = 70;}
            else if(Tm <= 58) {var score1 = 100;}
            else if(Tm <= 62) {var score1 = 80;}
            else if(Tm <= 68) {var score1 = 40;}
            else {var score1 = 20;}

            if (GC < 20) {var score2 = 0;}
            else if(GC <= 30) {var score2 = 20;}
            else if(GC <= 40) {var score2 = 50;}
            else if(GC <= 50) {var score2 = 100;}
            else if(GC <= 60) {var score2 = 90;}
            else if(GC <= 70) {var score2 = 60;}
            else if(GC <= 80) {var score2 = 20;}
            else {var score2 = 0;}

            switch(triplet)
            {
                case "AGG": {var score3 = 100;break;}
                case "TGG": {var score3 = 88;break;}
                case "CTG": {var score3 = 84;break;}
                case "ACC": {var score3 = 81;break;}
                case "TCC": {var score3 = 81;break;}
                case "CAG": {var score3 = 80;break;}
                case "AGC": {var score3 = 75;break;}
                case "GTG": {var score3 = 72;break;}
                case "TTC": {var score3 = 72;break;}
                case "CAC": {var score3 = 68;break;}
                case "TGC": {var score3 = 67;break;}
                case "CTC": {var score3 = 59;break;}
                case "GTC": {var score3 = 57;break;}
                case "TTG": {var score3 = 52;break;}
                case "AAC": {var score3 = 50;break;}
                case "ATC": {var score3 = 50;break;}
                case "CAT": {var score3 = 48;break;}
                case "GAG": {var score3 = 47;break;}
                case "TGT": {var score3 = 47;break;}
                case "ATG": {var score3 = 44;break;}
                case "AGT": {var score3 = 42;break;}
                case "GGC": {var score3 = 42;break;}
                case "GAC": {var score3 = 40;break;}
                case "GAT": {var score3 = 40;break;}
                case "AAG": {var score3 = 39;break;}
                case "CCC": {var score3 = 39;break;}
                case "GGA": {var score3 = 39;break;}
                case "ACT": {var score3 = 37;break;}
                case "GCA": {var score3 = 37;break;}
                case "GCC": {var score3 = 37;break;}
                case "TAG": {var score3 = 37;break;}
                case "AAA": {var score3 = 36;break;}
                case "ACA": {var score3 = 36;break;}
                case "CCA": {var score3 = 34;break;}
                case "CCG": {var score3 = 34;break;}
                case "TAC": {var score3 = 34;break;}
                case "GTA": {var score3 = 32;break;}
                case "ACG": {var score3 = 31;break;}
                case "TCA": {var score3 = 31;break;}
                case "TGA": {var score3 = 31;break;}
                case "CAA": {var score3 = 29;break;}
                case "CGG": {var score3 = 29;break;}
                case "AAT": {var score3 = 27;break;}
                case "GAA": {var score3 = 27;break;}
                case "GCT": {var score3 = 27;break;}
                case "GGT": {var score3 = 27;break;}
                case "TCT": {var score3 = 26;break;}
                case "AGA": {var score3 = 24;break;}
                case "CGC": {var score3 = 24;break;}
                case "CTT": {var score3 = 24;break;}
                case "GCG": {var score3 = 23;break;}
                case "TCG": {var score3 = 23;break;}
                case "CCT": {var score3 = 21;break;}
                case "CTA": {var score3 = 21;break;}
                case "GTT": {var score3 = 21;break;}
                case "TTT": {var score3 = 19;break;}
                case "ATA": {var score3 = 18;break;}
                case "TAT": {var score3 = 18;break;}
                case "GGG": {var score3 = 14;break;}
                case "ATT": {var score3 = 11;break;}
                case "CGT": {var score3 = 11;break;}
                case "CGA": {var score3 = 8;break;}
                case "TAA": {var score3 = 6;break;}
                case "TTA": {var score3 = 0;break;}
                default: break;
            }
            var score = 5 * score1 + 2 * score2 + 3 * score3;
            var text = "0000".slice(String(score).length) + String(score) + ',' + oligo + ',' + String(Tm);     //方便排序
            oligos.push(text);
        }               
    }
    if (oligos.length == 0) {
        alert("你的引物太难设计了，还是你自己来吧！");
        return;
    }else {
        oligos.sort().reverse();
        return oligos;
    }
}

最后编辑于：2020.06.20 11:23:42

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三联体	得分	三联体	得分	三联体	得分	三联体	得分
AGG	100	CAT	48	ACA	36	CGC	24
TGG	88	GAG	47	CCA	34	CTT	24
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TCC	81	AGT	42	GTA	32	CCT	21
CAG	80	GGC	42	ACG	31	CTA	21
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CAC	68	CCC	39	CGG	29	TAT	18
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ACC	81	ATG	44	TAC	34	TCG	23
TCC	81	AGT	42	GTA	32	CCT	21
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AGG	100	CAT	48	ACA	36	CGC	24
TGG	88	GAG	47	CCA	34	CTT	24
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