早就想开启文献阅读的章节，用输出倒逼输入，总算是开始啦。
这是一篇2021年8月发表在JCI(the Journal of Clinical Investigation)上的文章：细胞外基质蛋白层粘连蛋白β 1 调节小鼠的疼痛敏感性和焦虑抑郁样行为。
通讯作者是第四军医大学（空军军医大学）基础医学院神经生物学系武胜昔教授和罗层教授。团队长期从事慢性痛及其共病的神经机制与干预新策略研究，研究成果先后发表于Brain, Nat Commun, PLoS Biol, Pain等国际权威期刊，并受邀在Trends Neurosci发表特邀综述。
研究背景：
神经性疼痛通常与精神疾病共存，例如焦虑和抑郁，使其对经典治疗具抵抗力。因此开发一种新的有效治疗方法来治疗神经性疼痛中并存的精神疾病仍然是一项重大挑战。
前扣带回皮层（Anterior cingulate cortex, ACC）的细胞可塑性被认为是介导疼痛感知和情绪情感的关键脑区。之前的研究表明，ACC中的神经元被神经损伤激活，抑制前扣带回中的中枢可塑性会产生镇痛、抗焦虑和抗抑郁作用。但迄今为止，更多的关注点主要集中在细胞内的可塑性机制上，而触发和易化细胞内机制的细胞外变化长期被忽视。
细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）不仅作为细胞结构的支架蛋白，同时又是感受和向细胞内传递细胞外信息的特殊的第一信使。层粘连蛋白（Laminin）作为ECM的关键组成部分，其是由α亚基、β亚基和γ亚基构成的异三聚体糖蛋白家族，参与调控多种病理生理过程。
考虑到ACC 在疼痛感知和情绪方面的重要作用，作者开始研究ECM 的这种结构可塑性是否在神经损伤时发生在 ACC 中？如果发生，这种ACC ECM可塑性的生化基础是什么？细胞外ECM 异常如何促进ACC 中的细胞内信号转导通路并进一步导致神经性疼痛和相关的焦虑抑郁？
在 SNI（spared nerve injury，一种神经病理性痛模型。在无菌手术条件下，通过钝性剥离股骨肱二头肌来分离左侧坐骨神经分支。腓神经和胫骨神经均紧密结扎，并在结扎的远端横断，使腓肠神经保持完整。）模型中，作者观察到小鼠出现持久的过度疼痛反应，即机械性诱发痛和热痛觉过敏，且伴随焦虑和抑郁表型。
对于疼痛反应的检测，作者采用了机械回缩阈值测试（von Frey测试）和热痛觉测试。
机械回缩阈值测试（von Frey测试）使用校准的0.008-vonFrey纤维- 2.0 g（0.008、0.02、0.04、0.07、0.16、0.40、0.60、1.0、1.4和2.0 g）在一个高架网底平台（Danmic Global，CA，USA）上。从0.008 g开始，将纤维以足够的力施加到足底外侧表面，使纤维弯曲，并保持1s。对von Frey机械刺激的“积极反应”被定义为应用von Frey hairs后突然的脚抬起。每根hair刺激10次，记录抬爪反应频率。引起50%的爪子退缩频率所需的特定纤维的力被表示为机械阈值。
热痛觉测试：将小鼠被放置在一个温度控制的玻璃平台上，保持30℃恒温，用辐射热源（50 W卤素灯泡）刺激后爪的外侧足底表面。从刺激开始到爪子退缩的时间被记录为爪子退缩的热潜伏期。每只后爪测试5次，间隔5分钟，取退出潜伏期的平均值。
行为表型则是通过旷场实验（OFT）和高架十字迷宫实验（EPM）评估焦虑水平；通过悬尾实验（TST）和糖水偏好实验(SPT评估抑郁水平。
主要研究过程
为明确参与神经性疼痛和相关焦虑抑郁病理过程的基因，作者在SNI后第 56 天取了对侧ACC进行了RNA-Seq分析。一共检测到了565个差异表达基因 (DEG)，其中 418 个（74%）基因上调，147 个（26%）基因下调。 GO和KEGG分析发现与ECM-受体相互作用和粘着斑有关的途径高度富集。其中LAMB1，一种 ECM 成分，以前已知参与多种生理病理过程，在 SNI 后显示出显著的转录下调，这种下调在RNA和蛋白表达水平得到了验证，且主要在神经元中表达。
为明确LAMB1的变化与神经性疼痛和焦虑抑郁之间是否存在因果关系。作者构建了表达针对LAMB1和 EGFP 的 shRNA 的重组腺相关病毒 2/9 (AAV2/9)来敲减LAMB1。
与表达对照shRNA的小鼠相比，在右侧ACC中表达 shLamb1 的小鼠在假手术条件下(sham condition)对对侧而非同侧后爪的von Frey纤维丝有明显更强的反应。在悬尾试验(TST) 中，AAV-shLamb1 的表达导致假手术组小鼠的不动时间更长。蔗糖偏好测试也显示在 ACC 中敲低 LAMB1 后对蔗糖的偏好显著降低。表明ACC中的LAMB1 对神经性疼痛和疼痛相关的焦虑抑郁具有负调节作用。
以往的研究表明，ACC中结构和功能突触可塑性被认为是神经性疼痛和相关的焦虑抑郁的细胞基础。包括 LAMB1 在内的 ECM 分子与精神疾病中涉及的突触稳定、可塑性和化生有关。因此，作者首先通过高尔基体染色的方法确定了敲减LAMB1，假手术组的锥体神经元顶端和基底树突的树突复杂性增加。
其次，通过使用锥体神经元的全细胞膜片钳记录来评估LAMB1缺陷对 ACC 中突触传递的功能影响。一方面，敲减LAMB1，ACC中 锥体神经元的兴奋性显著增强，放电频率显著增加，基强度降低（足以引起刺激的最小电流强度)；AMPAR-eEPSCs的振幅远高于感染对照 RNA 的小鼠，AMPAR/NMDAR（NMDAR 介导的 eEPSC）比率更高，而NMDAR-eEPSCs的振幅在两组之间没有差异。
另一方面，敲低LAMB1后平均 PPR 显著降低，微型 EPSC (mEPSC) 频率的增加，同时，mEPSCs 的振幅在 LAMB1 缺失后增强，锥体神经元中 AMPA 诱导的 (50 μM) 电流因 LAMB1 的敲低而显著增强，而NMDA诱导的 (50 μM) 电流则没有。这些结果表明LAMB1缺陷通过突触前和突触后机制增强突触传递，这可能涉及突触前递质释放概率和突触后 AMPAR 反应性的增加。
那么，ACC中 LAMB1通过哪种机制调节树突棘重塑？研究表明，神经元中肌动蛋白细胞骨架的重排与spines形态和功能有关，也可能参与许多病理生理过程。聚合丝状肌动蛋白 (F-actin) 也被证明在周围炎症时初级感觉神经元中增加，且F-actin的破坏减轻了炎症疼痛。在体内ACC组织和体外培养的皮层神经元中用Phalloidin标记的 F-actin显示，与表达对照shRNA的神经元相比，表达shLamb1的神经元中F-actin显著增强提示 LAMB1 的缺失导致树突棘肌动蛋白组织异常。整合素最初被描述为细胞粘附的介质，连接细胞骨架和ECM 。为了确定 LAMB1 在 ACC 中是否相互作用以及与哪个整合素亚基相互作用，作者对总 ACC 细胞裂解物进行了免疫沉淀测定。发现LAMB1与整合素 β1 有强烈的相互作用，敲低LAMB1 在显著减弱了这种相互作用。层粘连蛋白-整合素系统被发现在少突胶质细胞发育过程中激活 Src 激酶家族 ，而 Src 激酶是肌动蛋白细胞骨架的已知上游调节剂。因此，作者使用针对 Src 磷酸化 Tyr416 的抗体进行了蛋白质印迹分析来验证 LAMB1 敲低小鼠的 ACC 中 Src 活性是否降低。观察到 ACC 中 LAMB1 敲低后 Src 磷酸化 (p-Src) 显著降低。该结果表明，LAMB1 的缺失导致 ACC 树突棘中 Src 活性介导的肌动蛋白重组。
Src可以通过小 GTP 酶 RhoA 调节肌动蛋白组织，是已知的 cofilin 活性和树突棘肌动蛋白组织调节剂。通过 ROCK/LIMK 通路激活的 RhoA 被证明可以通过诱导其在 Ser3 上的磷酸化来抑制肌动蛋白丝切蛋白，从而触发适当的spines重塑。此外，激活的 Src 可以磷酸化 RhoA 特异性 GTP 酶激活蛋白 (GAP) p190RhoGap，从而诱导其 GAP 活性并降低 GTP-RhoA 的水平。作者在LAMB1敲低小鼠中提取的 ACC 组织裂解物具有降低的酪氨酸磷酸化 p190RhoGAP 水平和增加的活性 RhoA 水平。鉴于 LAMB1 敲低小鼠中 RhoA 活性增加，RhoA 信号级联的下游效应子水平，如 ROCK2 和 LIMK2，在 ACC 中显著增强。LAMB1 敲低小鼠的总肌动蛋白丝切蛋白水平没有改变，但无活性形式的肌动蛋白丝切蛋白水平显著增加（p-肌动蛋白丝切蛋白；ROCK/LIMK信号转导的一个关键下游靶点是肌动蛋白丝切蛋白(cofilin)，它是主要的肌动蛋白解聚因子，可通过Ser3磷酸化失活)。表明活性形式的 cofilin 水平在 ACC 中的 LAMB1 敲减后下降。这些结果表明，ACC 中 LAMB1 缺失引起的spines重塑可能是由RhoA/ROCK/LIMK信号级联的 Src 依赖性激活引起的，导致活性cofilin水平异常降低并最终导致肌动蛋白重排。
鉴于RhoA信号和肌动蛋白(actin)稳定性在AMPAR膜运输中的重要性（48-51），以及观察到的对LAMB1敲减小鼠中增强的AMPAR -eEPSC，作者进一步研究了LAMB1敲减是否导致AMPARs向质膜运输的变化。结果显示，AMPAR亚基 GluR1 在 LAMB1 敲低小鼠中显著增强，而GluR2亚基没有观察到显著差异，这与在不同区域的突触可塑性过程中 GluR1 插入质膜的观察结果一致。除了 AMPAR，NMDA 受体 (NMDAR) 亚基 NR2A 在 LAMB1 敲低后也表现出增强的膜运输，而膜 NR1 和 NR2B 亚基基本未改变。此外，表达对照 RNA 的小鼠相比，表达 shLamb1 的小鼠的 ACC 质膜中突触后密度 95 (PSD95) 表达显著上调。这在体外培养的表达 shLamb1 的皮层神经元中得到证实。质膜中 AMPAR 和 NMDAR 的数量增加表明 LAMB1 敲减后 AMPAR 和 NMDAR 传递到突触后密度 (PSD) 质膜的增强。
此外，利用纤维光度法记录悬尾实验期间锥体神经元的活动。在悬尾过程中，表达 shLamb1 的小鼠的钙瞬变比表达对照RNA的小鼠引起的钙瞬变更大。表明在 LAMB1敲减小鼠中观察到的疼痛超敏反应和抑郁行为与 ACC 神经元活动增加有关。
最后，ACC LAMB1是否对神经性疼痛和厌恶情绪有治疗作用？作者通过ACC注射整合素β1 激活剂 pyrintegrin来进行过表达验证。将 pyrintegrin 递送至 ACC 可显著缓解SNI诱导的同侧机械异常性疼痛和热痛觉过敏，而对对侧痛觉过敏没有显著影响。此外，在SNI操作的小鼠中，在 ACC 内施用 pyrintegrin 增加了 EPM 中的张开臂探索而不影响总距离，减少了 TST 中的不动，并增加了蔗糖偏好。这表明 pyrintegrin在神经病理状态下具有理想的抗焦虑和抗抑郁作用。
Western blot分析显示，SNI 导致 p-Src 显著减少，p-cofilin显著增加，以及ACC中 PSD95 的显著上调，在 ACC 内注射 pyrintegrin 逆转了这些影响。此外，培养的皮层神经元中 LAMB1 敲低诱导的 F-肌动蛋白增强因培养基中存在的 pyrintegrin (1 μM) 而正常化。此外，pyrintegrin (20 μM) 的浴液应用在很大程度上缓解了 SNI 操作小鼠中 ACC 神经元的过度兴奋性（ pyrintegrin处理后 AP 频率降低和流变碱基升高)。pyrintegrin给药也显著缓解了神经病理状态下增强的AMPARs-eEPSCs。这些结果表明，pyrintegrin是通过 Src/cofilin 信号通路减轻神经性疼痛及其相关厌恶。
结论
周围神经损伤导致ACC中 LAMB1 的下调。这种与整合素 β1 的相互作用减少导致 Src 激酶磷酸化减少，从而导致 RhoA 特异性 GAP p190RhoGap 表达减少，从而增加 GTP-RhoA 水平。升高的 RhoA 水平激活 ROCK2，随后激活 LIMK2，后者磷酸化 cofilin 并使 cofilin 活性失活。这导致肌动蛋白细胞骨架的重排，进一步导致突触前递质释放概率增加以及异常的突触后spines重塑和AMPAR的突触运输，从而增强突触功能。由此产生的结构和功能可塑性共同导致疼痛反应加剧以及相关的焦虑和抑郁。
参考链接：
Li ZZ, Han WJ, Sun ZC, Chen Y, Sun JY, Cai GH, Liu WN, Wang TZ, Xie YD, Mao HH, Wang F, Ma SB, Wang FD, Xie RG, Wu SX, Luo C. Extracellular matrix protein laminin β1 regulates pain sensitivity and anxiodepression-like behaviors in mice. J Clin Invest. 2021 Aug 2;131(15):e146323. doi: 10.1172/JCI146323. PMID: 34156983; PMCID: PMC8321574.
