前期记录
先确定目标基因
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（1）
然后对目的基因进行背景调查
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（2）磨刀不误砍柴工
设计sgRNA及引物
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（3）sgRNA及引物设计
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（4）构建sgRNA+Cas9载体
golden gate构建好载体，酶切验证成功
293FT细胞转染验证
（1）sgRNA+pSpCas9载体用lipofectamine 3000转染至293FT细胞（按照转染试剂的说明书走），确保转染效率> 70%；
（2）72 h后收集细胞提取基因组DNA（按照基因组DNA提取试剂盒的说明书操作）；
（3）使用事先设计好的引物进行PCR扩增，这里使用的酶是NEB公司的Q5 high-fidelity Polymerase，一切按照该酶的说明书严格操作；
（4）将目的条带切割下来并使用胶回收试剂盒回收DNA条带，一切按照胶回收试剂盒说明书进行操作；
（5）回收后的DNA样本，经T7 Endonuclease I 酶解验证错配DNA，部分结果如下：
验证成功，开始正式实验
时间飞逝，上次说提取质粒后验证，这部分就花了一天时间；加上打台风影响细胞复苏，耽误了1-2天，复苏细胞后隔一天立刻传代种板，第二天发现细胞稍微少了一点，又等了一天，转染后虽然是72h应该收sample，但细胞数目略少，可能提取不到足够的基因组DNA，所以让细胞又长了一天，直到百分之80以上的融合度（因为我用的是24孔板）。基因组DNA提取之后立刻进行Q5PCR，跑胶切胶回收，T7EI酶切再跑胶，这个骚操作一天做不完，分了两天做，所以就一下子花了将近十天时间，嘤嘤嘤，这要放在其他组，可能都要被老板骂死了。
为啥不提前准备好细胞，为啥不计数种板，为啥为啥为啥为啥，事实上我自己也觉得不满意，但好在最终得到了想要的结果，在还不确定自己的操作是否足够风骚的时候，请务必要小心谨慎，毕竟每一步都有可能出问题。我在新手期曾遇到过的问题如下：
转染效率没达到百分之70，最后找到原因是因为转染试剂过期，加大量之后就搞定了；
基因组DNA提取效率低，仅仅有几到十几ng/μL，质量也很差。这里需要注意的是，293FT细胞非常脆弱，一方面要保证足够的细胞量，另外一方面，由于该细胞贴壁不牢，可直接吹下收集去裂解，而不需要使用胰酶消化下来，再终止离心收集去裂解提取基因组DNA。
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Q5 PCR可能会出现问题，一般情况下Q5PCR是很稳妥的实验，但是前天我有一套sample全部都没有出条带，一时半会不能找到原因在哪里，这种时候我会将引物丢弃，重新配置PCR体系，保留原条件的同时，增加extension time，结果令人满意，不仅是原条件，新条件都出现了目的条带。说明我可能是在配样的过程中出现了问题。因此还是建议样本量大的时候还是要尽量耐心去check每一个步骤或者直接分开操作。
image.png Q5PCR说了，在不加错样的情况下，一般是没有难度的，但一般胶回收可能会出现问题，同样是浓度低。那么需要注意的就是，琼脂糖凝胶尽量配厚一点，不要让样本从上样孔里面溢出来，一点点都不能浪费，那么操作胶回收实验的时候也要尽量保证不浪费，尽可能保留多一些DNA fragment，但最好的解决办法就是在Q5PCR步骤时要获取足够多的PCR产物。
